Введение
Ремонтантные формы малины — уникальные ягодные растения, способные в отличие от обычных растений малины плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины обладают низким потенциалом вегетативного размножения по сравнению с летними сортами, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе [3].
Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. По сравнению с традиционными способами размножения малины — корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ. Главные из них высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции.
За последние десятилетия в нашей стране и за рубежом были проведены многочисленные иссле-дования по совершенствованию метода клонального микроразмножения с целью производства высококачественного посадочного материала малины [5, 14]. Выполненные работы позволили определить оптимальные сроки изолирования эксплантов, оптимизировать состав питательных сред, отработать приемы адаптации полученных растений к нестерильным условиям выращивания. В настоящее время этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала малины в некоторых селекционных программах [7].
Однако биологические особенности ремон-тантных форм малины, связанные с их сложным межвидовым происхождением, стали причиной низкой эффективности предлагаемых биотехно-логических методов размножения малины на не-которых этапах культивирования in vitro. В связи с этим возникла необходимость оптимизации процесса клонального микроразмножения новых ре-монтантных форм малины.
Материалы и методы исследования
Весь селекционный материал ремонтантной малины (220 генотипов), используемый нами в работе, был создан на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.). Исследования проводились в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА.
Изолирование эксплантов осуществляли в конце лета — начале осени, либо в осенний период. Заготовленные побеги хранили в бытовом холодильнике, при температуре 4 °С. Сегменты стебля с почкой стерилизовали в 0,1 % растворе сулемы (HgCl2) или 0,1 % мертиолята (C9H9HgNaO,S) в течение 3 минут с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Культивирование первичных эксплантов и последующее размножение осуществляли в модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина вводили 6-бен- зиламинопурин (6-БАП) 0,5 мг/л, тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,2 мг/л, N-(2 хлор- 4-пиридил)-Ы-фепилмочевина (CPPU) в концентрации 0,2-1 мг/л. При размножения растений изучали влияние цитокининов 6-БАП в концентрациях 0,5-2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05, 0.1 и 0.2 мг/л.
На этапе укоренения использовали часть минеральной среды Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов ризогенеза в среду вводили ПУК или ИМК.
Результаты и обсуждения
Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов — конец мая, начало июня. Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выявлена и на ремонтантных формах малины [4]. Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых, ограниченное число подходящих почек, которые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов. При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/пли не- приживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифферен- цировка почек по цветочному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при заготовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов.
В настоящее время изолирование эксплантов ремонтантных генотипов малины проводится нами в осенний период, сразу после их селекционной оценки. Однако большинство почек у малины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культивировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Рост степени приживаемости эксплантов и регенерации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины — тидиазурон и CPPU, которые в низких концентрация (0.1-0.2 мг/л) оказались более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда.
Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их раз-множения. При этом даже в загущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек, сформировавшихся на однолетних побегах, быстрее чем в весенний период, происходит регенерация растений, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения антисептиками при стерилизации.
Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной степени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов и, как исключительное явление, их распускание. Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образования не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие побеги сохраняют активный рост.
Регенерация побегов из пазушных почек про-исходит по периферии их основания из запасных меристем. В среднем образуется около 2 побегов на эксплант. Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цветочных зачатков возможна адвентивная регенерация из них побегов. Однако в связи с возможным появлением сомаклональных вариантов при таком типе регенерации [2] его необходимо применять лишь в исключительных случаях.
Известно, что регенерационный потенциал на-ходится в прямой зависимости от его генотипа. Так, в ряде исследований продемонстрировано, что среди представителей рода Rubus ежевика отличается большим, чем малина, коэффициентом размножения in vitro, а также частотой регенерации при адвентивном органогенезе [12]. Среди представителей одного вида растений могут вы-делятся сорта как с большей, так и с меньшей регенерационной способностью. Возможно, что признаки, определяющие способность к размно-жению у растений in vitro, коррелируют с такими показателями в полевых условиях. Однако основа-тельных экспериментов, подтверждающих это на ремонтантных формах малины, не проводилось, несмотря на актуальность такой информации при планировании работы по тиражированию сортов с использованием культуры ткани. В наших исследо-ваниях при включении большого количества гено-типов было зафиксировано, что высокорослые, ак-тивно растущие в полевых условиях сорта ремон-тантной малины сохраняют такую же способность и в условиях in vitro. Так, из межвидовых сортов ремонтантной малины большим коэффициентом размножения и способностью к ризогенезу in vitro отличается сорт Бабье лето-2, а у трудно укореняе-мого in vitro сорта Геракл в полевых условиях наряду с низкорослыми побегами образуется слабая по сравнению с другими сортами корневая система. Такую же аналогию можно провести между низко-рослым сортом Пингвин, который отличается от-носительно низким коэффициентом размножения в естественных условиях, и высокорослым, активно растущим сортом Оранжевое чудо.
Среди сортов, выделенных из сотен элитных сеянцев нами не было отмечено генотипа, который бы не поддавался удовлетворительному размножению in vitro на стандартных средах с 6-БАП (1-2 мг/л). Однако выделялись генотипы, обладающие очень низкими коэффициентами размножения (не более 2): 6-Х-Ж, 15-220-2 и 16-67-1.
Из существующих способов увеличения коэф-фициента размножения малины можно выделить следующие:
Не исключено, что новыми способами индукции образования дополнительных побегов могут быть и другие химические и физические факторы.
Из испытанных питательных сред, приготовлен-ных по прописям Мурасиге-Скуга [10], Андерсона [6] и Ли и де Фоссарда [9], первая оказалась наиболее оптимальной для культивирования малины на этапах введения в культуру, собственно размножения и укоренения (1/2 часть). Среда Мурасиге- Скуга (МС) использовалась в большинстве случаев при размножении малины in vitro. Однако следует учитывать, что эта среда в нашей работе содержит тройную концентрацию хелата железа по сравнению с оригинальной прописью.
Среди физических факторов критическое влияние на культивирование малины in vitro оказывает температура. Высокие значения этого показателя (около 30 °С), отмечаемые в весенне-летний период в отсутствии кондиционирования, могут привести к значительным потерям растительного материала. При воздействии высоких температур происходит интенсивное выделение растительными тканями этилена и углекислоты, которые в изолированной системе in vitro накапливаются в высоких концентрациях. Этилен, являясь гормоном старения и созревания, приводит к быстрой гибели растений, особенно уже закончивших рост. В связи с этим при выращивании растений in vitro целесообразно искусственно поддерживать оптимальную температуру в культивационном помещении или избегать размножения растений в жаркие месяцы. Несомненный интерес представляет информация, связанная с определением оптимальных температур и термопериода для культивирования растений малины на каждом этапе клонального микроразмножения. В большинстве случаев в научных работах рекомендуют культивирование растений малины при температуре 20-22 °С [13].
Традиционно для индукции ризогенеза микро-черенков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. На средах с ИУК укореняются лишь на 30-40 % микрочеренков, и для них более эффективна ИМК (0,5 мг/л).
Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза — до 100 %.
Перспективное направление в получении по-садочного материала малины — укоренение микро-побегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1 с.
Успех укоренения определяется качеством ис-ходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений у крупных побегов выше, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов). На нем проводят уменьшение концентрации цитокинина 6-БАП с 1-2 мг/л до 0,2-0,3 мг/л.
Для ускорения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию вита- минно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины. Полученные результаты позволяют заключить, что введение в питательную среду МС витамин- но-минерального комплекса «Компливит» (4 г/л) приводит к росту коэффициента размножения и высоты растений. Такой эффект очень важен на последнем в субкультивировании этапе элонгации для получения более крупных побегов.
Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений (слабым функционированием устьичного аппарата, отсутствием кутикулярного слоя и корневых волосков) может наблюдаться значительные потеря высаженного в субстрат материала [11]. Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его pH, влажность и температура воздуха.
В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады, состоящих из общего поддона, кассет и полупрозрачной крышки, обеспечивающей высокую влажность среды. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно проводится опрыскивание растений и полив по мере необходимости.
После одного-двух месяцев адаптации в ми-нипарниках, укорененные растения малины с не-сколькими образовавшимися листочками распи-кировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа «Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений.
Микроклональное размножение селекционных форм ремонтантной малины с использованием новых регуляторов роста Озеровский Александр Владимрович
Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. Использование биотехнологических методов в селекции ремонтантных форм малины 9
1.1 Характеристика объекта исследований 9
1.2 Микроклональное размножение растений 11
1.3 Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro 19
1.4 регуляторы роста растений 24
1.4.1 Биопрепараты на основе симбионтных грибов 29
1.4.2 Регуляторы роста на основе фурфурола 30
1.5. Современные методы исследования генома растений 33
1.5.1 Морфо-фенотипические и биохимические методы 33
1.5.2. Задачи решаемые ПЦР 36
1.6 Использование молекулярных маркеров в изучении генома и селекции малины 38
ГЛАВА 2. Методики и условия окружающей среды 42
2.1 Место проведения и объекты исследований 42
2.2 Методики исследований 47
2.2.1 Методика микроклонального размножения 47
2.2.2 Методика получения регенератов ремонтантной малины 50
2.2.3 Методы по определению генома малины 51
2.2.3.1. Выделение геномной ДНК 52
2.3 Климатические и почвенно-агротехнические условия проведения исследований 53
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 63
3.1 Микроклональное размножение ремонтантных форм малины 63
3.1.1 Введение новых генотипов 63
малины в культуре in vitro 68
3.1.3 Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на их
регенерационную способность в культуре in vitro 74
3.1.4 Влияние регуляторов роста на развитие побегов малины в культуре in vitro 78
3.1.5 Адаптация к нестерильным условиям 84
3.2 Регенерация ремонтантных форм малины из листовых эксплантов 89
3.3 Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины при микроклональном размножении. 94
ГЛАВА 4. Экономическая эффективность применения регуляторов роста при микроклональном размножении ремонтантной малины 97
Список используемой литературы 101
Актуальность темы. Выращивание сортов ремонтантного типа, наряду с обычными сортами дает возможность создать в условиях средней полосы России конвейер поступления свежих ягод малины в течении 2,5-3 месяцев, начиная с конца июня и до наступления осенних заморозков. При этом реализация ягодной продукции ремонтантных сортов в «несезонное» для малины время по более высоким, чем летом ценам стимулирует расширение насаждений малины во всех категорий хозяйств (Казаков, 2001).
Возделывание ремонтантных сортов малины по типу однолетней культуры снимает проблему зимостойкости стеблей, а их удаление с плантации после скашивания позволяет избавиться от основных болезней и вредителей без применения пестицидов. Использование в производстве сортов ремонтантного типа с неполегающими под тяжестью урожая стеблями создает возможность максимальной механизации по уходу за насаждениями, включая машинную уборку урожая. При этом отпадает необходимость в устройстве дорогостоящей шпалеры, подвязке стеблей к проволоке и их поштучной вырезке после плодоношения (Казаков, 2000).
Актуальной проблемой при создании таких сортов является оптимизация селекционного процесса. Ремонтантные формы малины сложного межвидового происхождения отличаются низкими коэффициентами происхождения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли. Данная биологическая особенность увеличивает период полевого размножения, и следовательно значительно удлиняет процесс перехода элитных форм к сортоиспытанию. Поэтому для ускорения селекционного процесса актуально использование метода микроклонального
размножения растений. Гибриды сложного межвидового происхождения резко отличаются по реакции на условия культивирования in vitro. Поэтому для новых селекционных форм требуется индивидуальный подбор условий на всех этапах микроклонального размножения. Следует отметить, что некоторые ремонтантные формы обладают низким коэффициентом размножения даже в культуре in vitro, поэтому применение новых препаратов стимулирующего действия является весьма актуальным.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы была оптимизация условий микроклонального размножения новых ремонтантных форм малины, испытание влияния новых регуляторов роста в культуре in vitro. В ходе работы решались следующие задачи:
— определение эффективности использования цитокинина CPPU на
этапе введения в культуру in vitro и при получении регенерантов
ремонтантных образцов малины;
— изучение реакции новых форм малины на условия микроклонального
размножения;
— изучение возможности использования фитогеля в качестве
желирующего вещества при клональном микроразмножении;
— определения эффективности концентраций новых регуляторов роста
растений при стимулирования физиологических процессов протекающих в
растениях ремонтантной формах малины в культуре in vitro;
— проверка сцепления молекулярного маркера с признаком
ремонтантности у новых селекционных форм малины.
Научная новизна исследований. Подобраны условия для культивирования in vitro 52 новых ремонтантных форм малины. Показана высокая эффективность CPPU на этапе введения в культуру новых форм ремонтантной малины, экспланты которых обладают низкой адаптивной
7 способностью к условиям in vitro, а также при стимуляции регенерации
побегов из листовых эксплантов.
Впервые продемонстрирована высокая эффективность новых
регуляторов роста растений негормональной природы при микроклональном
размножении ремонтантной малины.
Практическая значимость. Оптимизированные методики культивирования in vitro активно применяются для размножения новых элитных форм как на этапе первичных отборов, так и подготовки сортов для передачи в сортоиспытание. За время работы в селекционный питомник передано 3772 растений 64 форм. Применение микроклонального размножения позволяет ускорить селекционный процесс на 3-4 года.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и
8
рекомендаций для практической селекции. Работа содержит 18 таблиц и 15
рисунков. Список использованной литературы включает 204 наименования, в
том числе 57 на иностранных языках.
Характеристика объекта исследований
Данные сорта продлевают сезон потребления свежих ягод до первых заморозков. Недостатком большинства зарубежных сортов является то, что для полного созревания урожая требуется безморозный период 150-160 дней и сумма активных температур не менее 3000С, а для Брянской области она обычно составляет 2100-2300С. Потенциальная урожайность из-за этого реализуется только на 15-20%(Казаков, 1994).
Плодотворная работа по созданию сортов малины ремонтантного типа, проводится на Кокинском опорном пункте ВСТИСП, где собрана многочисленная коллекция ремонтантных сортов и форм. Ежегодно из тысяч сеянцев, полученных благодаря межвидовой и внутривидовой гибридизации малины, отбирают генотипы, которые выделились по каким-либо хозяйственно- ценным признакам: по размеру, вкусовым качествам и плотности ягод, по устойчивости к болезням и вредителям, по срокам плодоношения дружности созревания урожая, по возможности механизированной уборки урожая, по типу формирования урожая и высоте побегов. Лучшие образцы используют в селекции, а некоторые внедряют в производство (Попова и др., 1997; Бычков, Кротов 1980; Куминов и др., 1981; Лукин, 1981; Кудасова, 1981; Кольцова, 1983; Бургомистров, 1985; Ярославцев, 1987; Зотова, 1987; Протасов, Утков, 1987; Соколова, 1987; Стрекач, 1987; Прохоров, Горобец, 1992).
Ряд ценных отборов сложного межвидового происхождения отличаются очень низким коэффициентом размножения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли (Казаков, 1994,1995). Это свойство является следствием физиологических особенностей ремонтантных форм, у которых метаболизм всего растения направлен на формирование урожая на побегах текущего года, а основной объем ассимилятов потребляется молодыми растущими побегами и развивающимися плодоэлементами. Из-за этого формирование корневых отпрысков резко замедляется, следовательно и вегетативное размножение ремонтантных форм намного ниже, чем у обычных гибридов.
Решить проблему размножения генетически ценного материала и ускорить селекционный процесс возможно, применяя метод клонального размножения. Этот метод широко используется на многих плодовых и ягодных культурах, в том числе и на малине, для получения большого количества высококачественного посадочного материала за короткое время (Высоцкий, 1995, 1996; Стахеева, 1998).
Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro
Большой прогресс, достигнутый в разработке способов генетической трансформации высших растений, открывает совершенно новые перспективы для целей практической селекции. Важнейшим ограничивающим фактором является проблема регенерации целых растений из трансформированных тканей (Schuerman, 1993).
Дифференцировка тканей экспланта и характер морфогенеза зависит от генотипа исходного растения, эпигенетической характеристики экспланта и внешних условий (Лутова, 1994; Бутенко, 1999).
Регенерация растений из культуры тканей может происходить следующими путями: соматический эмбриогенез и органогенез (Тиссера, 1989).
Регенерация адвентивных побегов растений рода Rubus была показана на листьях (Swartz, 1981, 1987, 1990), черешках (Cousineau, 1991), листовых дисках и участках междоузлий (Меркулов, 1993; Муратова, 2003, семядолях (Fiola, 1986,1990) и зрелых зародышах (Fiola, 1989).
Молодые листья малины, изолированные с верхушек растений, обладают большей частотой регенерации и образуют большее количество побегов на эксплант в сравнении с листовыми пластинками нижних ярусов (Туровская, 1993).
Из химических обработок эксплантов в культуре in vitro может применятся выдерживание их в концентрированном растворе 2,4-Д (Хамукова, 1994). Изменение органогенного потенциала листовых эксплантов для двух гибридов Rubus удалось добиться с помощью предварительной культивации исходных растений на среде с тидиазуроном (Swarz, 1990).
По результатам исследований ряда авторов оптимальные инкубационные условия заключаются в выдерживании эксплантов в течении двух недель в темноте с последующим переносом на свет. Исследователи две недели выдерживали листья в темноте, поместив их адаксиальной поверхностью к среде, что позволило повысить регенерацию до 56% (Swarz, 1990). В тоже время по результатам американских ученых, обработка темнотой была неблагоприятна для регенерации ежевики, при этом ауксины в питательной среде отсутствовали (Fiola, 1990).
Решающим фактором при получении регенерантов является присутствие экзогенных гормонов. На ранних этапах исследований по регенерации малины в качестве источников цитокининов использовали 6-БАП, однако процент регенерации редко превышал 20% (Fiola, 1990). Увеличение количества регуляторов роста выше 3-5 мг/л не приводило к повышению частоты регенерации (Хамукова, 1994).
В последнее время в качестве цитокинина используют тидиазурон. Он более эффективен, чем 6-БАП, при стимулировании процессов каллусообразования (Высоцкий, 1992), а также при пролиферации и регенерации адвентивных побегов из листьев некоторых древесных пород (Kerns, 1986; Read, 1992). Тидиазурон также более эффективен при получении регенерантов малины (Cousineau, 1991).
Тидиазурон хорошо себя зарекомендовал при получении регенерантов из меристематических тканей, а также из семядолей малины и ее гибридов (Hall, 1986). На различных генотипах была получена регенерация из листовых и стеблевых тканей (Graham, 1990, 1995). Для проявления наибольшего регенерационного потенциала малины хорошо себя зарекомендовал тидиазурон в концентрации 1 мг/л. (Fiola, 1990).
Методика получения регенератов ремонтантной малины
При оптимизации условий регенерации использовали листья укорененных пробирочных растений ремонтантной малины, которые предварительно были получены из апикальных меристем и размножены в лаборатории биотехнологии БГСХА. Пробирочные растения культивировались на питательной среде следующего состава: МС (Murashige and Skoog., 1962). Состав среды приведен в таблице 1. Среды готовили из концентрированных растворов макросолей (20 х), микроэлементов (100 х), Fe-хелата (200 х) и витаминов (100 х), добавляли инозит, сахарозу, агар (Difco), стерилизовали автоклавированием (1,2 атм, 20 мин.). рН среды доводили раствором NaOH. 6-БАП и ИМК добавляли перед автоклавированием. Посуду стерилизовали прокаливанием 25 минут или автоклавированием. Тидиазурон и антибиотики добавляли непосредственно перед использованием. Клональное микроразмножение проводили в присутствии 6-БАП 2 мг/л, укоренение побегов ИМК 0,5 мг/л. При приготовлении растворов гормонов использовали 96 % С2Н5ОН.
В опытах по регенерации изучали влияние гормональных факторов (тип цитокинина и его концентрация), влияние фотопериода, а также физиологических факторов на проявляемую регенерационную способность.
Источником эксплантов служили апикальные листья и черешки изолированные от укорененных in vitro растений. На изолированные листовые пластинки наносили поранения в области центральной жилки и помещали на питательную среду в пробирки Флоринского. Для повышения выхода регенерантов экспланты первые 10 дней выдерживали в темноте с последующим переносом на свет. После образования первых регенерантов периодически проводили учет вновь образующихся морфогенных структур. Спустя 1,5-2 месяца определяли конечное число образовавшихся побегов и их количество на эксплантах.
Микроклональное размножение ремонтантных форм малины
Селекционная практика свидетельствует, что на создание нового сорта с учетом всех этапов его формирования в лучшем случае требуется 12-15 лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю.
Еще более длительным оказывается путь создания сортов малины с использованием межвидовой гибридизации, нередко необходимой для радикального совершенствования исходного материала. В этом случае часто приходится преодолевать трудности, связанные с плохой скрещиваемостью родительских форм, низкой фертильностью потомства, бесплодием. Требуется немало времени для подбора оптимальных экотипов и форм для гибридизации, проведений серий возвратных скрещиваний, неоднократного пересева семян от малоплодовитых гибридов, использование мутагенеза и других приемов.
Метод микроклонального размножения позволяет получить в сравнительно короткий срок необходимое количество генетически идентичных растений. Сроки создания и оценки новых ремонтантных форм можно сократить в 1,5-2 раза, размножив в течении года до необходимого количества и высадить на участок. В зависимости от генотипа срок размножения элит в полевых условиях может занять до 5 лет. По трем урожаям этой посадки дается оценка испытываемых форм в сравнении со стандартом и выделяются элиты для представления их в качестве нового сорта. Именно таким путем удается на 4-5 лет сократить сроки создания и подготовки к передаче в госсортоиспытание ряда межвидовых форм малины.
В таблице 18 показана возможная сравнительная эффективность закладки новых питомников ремонтантной малины на примере сорта Геракл. Исследуются производственные затраты при использовании стандартной методики микроклонального размножения и оптимизированной с применением регуляторов роста.
Как видно из представленной таблицы методики микроклонального размножения не рентабельны. Применение новых регуляторов роста в данном случае приводит только к уменьшению затрат. Отрицательная рентабельность, в данном случае, является не производство посадочного материала на реализацию, а ускорение селекционного процесса. Рентабельность будет положительной, если учесть сокращение затрат на выведение нового сорта и экономической эффект от его внедрения.
Показана высокая эффективность применения новых регуляторов роста негормональной природы (Эмистим, Цитрон, Кавказ, Крезацин) в процессе микроклонального размножения ремонтантной малины. Они стимулируют укореняемость растений в 1,5-2 раза и увеличивают коэффициент размножения на 20-50 %. Действующая концентрация препаратов на несколько порядков ниже, чем обычно используемые регуляторы гормональной природы и составляет 0,0003-0,0015 мг/л.
Применение хлорфенилпередилмочевины (CPPU) обеспечивает высокую приживаемость фрагментов почек при введении новых форм ремонтантной малины в культуру in vitro, свыше 90% даже для форм плохо приживающихся в присутствии TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 0,2-1 мг/л.
Использование в качестве цитокинина CPPU при регенерации листовых эксплантов побегов ремонтантной малины обеспечивает повышение регенерации в 2-3 раза по сравнению с TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 1 мг/л, что на порядок выше оптимальной концентрации TDZ.
Замена агар-агара на фитогель при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro нецелесообразна. Фитогель вызывает угнетение корнеобразования и значительную гибель растений на этапе размножения.
Потенциальная способность почек ремонтантной малины к размножению в культуре in vitro зависит от месторасположения почки на однолетних побегах замещения. С 1 по 5-7 почку наблюдается значительное увеличение коэффициентов размножения (примерно в 2 раза у сорта Бриллиантовой и на 30% у Геракла). После этого происходит небольшое снижение коэффициента в центральной части побега и начиная с 13-15 почки коэффициент размножения снова существенно возрастает до максимальных значений.